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RP2E INRA Université de Lorraine

Publications

The naturally competent strain Streptococcus thermophilus LMD-9 as a new tool to anchor heterologous proteins on the cell surface

Microbial Cell Factories, 13 (1), pp. 82-82.

Lecomte, X., Gagnaire, V., Briard-Bion, V., Jardin, J., Lortal, S., Dary, A., Genay, M.

2014

CONTEXTE:
Des études fondamentales aux procédés industriels, la synthèse de protéines hétérologues par des micro-organismes est largement utilisée. La sécrétion de protéines hétérologues solubles dans le milieu extracellulaire facilite leur récupération, tandis que leur fixation à la surface de la cellule permet l'utilisation de cellules hôtes recombinantes comme supports de protéines ou de peptides. Un des points clés pour mener à bien l'expression hétérologue est de choisir l'hôte approprié. Nous proposons d'élargir le panel des hôtes de sécrétion hétérologues en utilisant Streptococcus thermophilus LMD-9. Cette bactérie lactique a un statut GRAS, est largement utilisée dans la fabrication de yaourts, laits fermentés et fromages, et est facilement transformable par compétence naturelle. Cette étude démontre la faisabilité de la sécrétion d'une protéine hétérologue ancrée à la surface de S. thermophilus. Pour cela, nous avons utilisé la cell envelope proteinase (CEP) PrtH de Lactobacillus helveticus CNRZ32 CIRM-BIA 103.


RÉSULTATS:
En utilisant S. thermophilus LMD-9 comme souche de base, trois souches recombinantes ont été construites: i) un contrôle négatif correspondant à S. thermophilus PrtS-mutant dans lequel le gène codant pour la CEP PrtS a été partiellement délété; ii) un mutant PrtH+ exprimant la pro-protéine PrtH de L. helveticus avec son propre motif d'attachement à la paroi cellulaire (de type S-layer) et iii) un mutant PrtH+WANS exprimant la pro-protéine PrtH avec le motif d'ancrage LPXTG de PrtS. Les niveaux d'expression des gènes prtH+ et prtH+WANS ont été mesurés par RT-PCR quantitative dans les mutants correspondants comparés à celui du gène prtS dans la souche sauvage LMD-9. Les niveaux d'expression des deux gènes recombinants, quel que soit le motif d'ancrage, ont atteint jusqu'à 76% du niveau d'expression de prtS. Les CEP ont été recherchées et identifiées sur la surface de la souche sauvage LMD-9 et des 2 mutants PrtH+ et PrtH+WANS en utilisant la technique du shaving suivie par l'identification des peptides par spectrométrie de masse, ce qui démontre que la sécrétion hétérologue et l'ancrage d'une protéine de plus de 200 kDa était efficace. L'ancrage à la paroi cellulaire semble être plus efficace lorsque le motif LPXTG de PrtS a été utilisé à la place du motif S-layer de PrtH.


CONCLUSIONS:
Nous avons démontré que S. thermophilus LMD-9 était capable de sécréter une protéine hétérologue de poids moléculaire élevé, et probablement de l'ancrer de manière covalente à la paroi cellulaire.

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