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RP2E INRA Université de Lorraine

Masters - Thèses - HDR

Contribution à la mise au point de l'outil R-IVET (Recombinase Based In vivo Expression Technology) chez Streptococcus thermophilus

Mémoire de Master 2ème année mention BAAN, spécialité SPBA

Gaci, N.-A.

2011

Streptococcus thermophilus est un germe très peu versatile, il colonise habituellement des niches
écologiques très restreintes comme le lait et les végétaux. De récentes études révèlent sa capacité à
survivre au transit gastro-intestinal (TGI) sous une forme très active. Pour caractériser l’état
physiologique adopté par la bactérie dans le TGI, l’équipe PB2P a mis en place l’outil R-IVET
« recombinase based in vivo expression technology » chez S. thermophilus. Il s’agit d’un outil
génétique basé sur la fusion transcriptionnelle permettant de piéger les promoteurs induits dans des
conditions complexes, comme lors du passage dans le TGI. Dans cette situation, cela permet donc
d’identifier les fonctions activées chez la bactérie durant son passage dans l’estomac et dans l’intestin.
L’outil R-IVET construit chez S. thermophilus comporte deux composants : un vecteur plasmidique
porteur du gène codant la recombinase spécifique de site Cre dépourvu de son promoteur (‘cre) et une
cassette chromosomique comportant un gène marqueur flanqué des sites de reconnaissance de la
recombinase Cre, les sites lox. Le clonage en amont du gène ’cre d’une séquence promotrice entraine
l’expression du gène de la recombinase et donc l’excision de la cassette chromosomique.
Dans le cadre de ce travail, le plasmide pBank porteur du gène ‘cre a été introduit dans les deux
souches de S. thermophilus LMD-9 et PB302 par transformation naturelle ainsi que la cassette
chromosomique portant le gène de résistance à la spectinomycine bordée par les sites lox. Les deux
souches recombinantes ont été analysées pour leur capacité à maintenir la construction R-IVET. Nous
avons testé la stabilité du vecteur pBank in vitro et in vivo chez la souris ainsi que l’impact sur la
croissance de la mutation, engendrée par l’insertion chromosomique de la cassette. Finalement, la
fonctionnalité de l’outil R-IVET a été testée en clonant le promoteur du gène hsp en amont du gène
‘cre du vecteur pBank et en analysant si la cassette chromosomique était délétée.

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