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RP2E INRA Université de Lorraine

Masters - Thèses - HDR

Contribution des protéases pariétales dans l'activité des systèmes protéolytiques de surface de Lactobacillus helveticus et Streptococcus thermophilus en matrice laitière

Thèse de l'Université de Lorraine, soutenue le 27 novembre 2014

Lecomte, X.

2014

Les produits laitiers fermentés sont régulièrement consommés et appréciés en Europe et dans les pays développés. L'hydrolyse des protéines du lait, telles les caséines, lors de la fermentation par les bactéries lactiques, contribue aux propriétés de ces produits fermentés. En effet, cette protéolyse peut aboutir à la génération de peptides technofonctionnels, agissant sur les qualités organoleptiques du produit, et/ou des peptides bioactifs qui ont un effet positif sur notre organisme. La protéolyse est réalisée par le système protéolytique des bactéries lactiques, composé de trois types d’acteurs : les protéases de paroi, les transporteurs de peptides et les peptidases. Les premiers acteurs de la protéolyse sont les protéases de paroi qui, en raison du contact direct avec le substrat lait/matrice laitière, orientent la protéolyse en initiant l’hydrolyse des protéines et des gros peptides.

Parmi les bactéries lactiques, deux espèces sont utilisées comme co-levains dans la fabrication de fromages à pâte pressée cuite tel que le Comté ou l'Emmental : Streptococcus thermophilus et Lactobacillus helveticus. S. thermophilus, comme la majorité des espèces des bactéries lactiques, peut produire une protéase de paroi, PrtS. L. helveticus présente, quant à elle, une situation originale car elle peut posséder jusqu'à 4 protéases de paroi, PrtH, PrtH2, PrtH3 et PrtH4 comme c’est le cas de la souche CNRZ32.

L’objectif de ce travail de thèse est de mieux comprendre les propriétés protéolytiques de L. helveticus et S. thermophilus en déterminant comment leur système protéolytique module le profil d’hydrolyse des caséines en matrice laitière. Face aux difficultés rencontrées dans la purification de chacune de ces protéases et le manque d’outils génétiques chez L. helveticus pour déléter les gènes de ces dernières, une stratégie basée sur l’expression hétérologue de ces protéases chez S. thermophilus a été choisie. Ainsi, la protéase PrtH de L. helveticus CNRZ32 a été produite de façon hétérologue chez S. thermophilus LMD-9. Cette sécrétion hétérologue a permis d’une part de montrer la faisabilité de la sécrétion puis de l'ancrage d'une protéine hétérologue à la surface de S. thermophilus et d’autre part de soulever des questions quant à l'activité de chacune des protéases de paroi de L. helveticus. Afin d'y répondre, des souches de L. helveticus ne produisant qu'une seule protéase de paroi ainsi que la souche modèle L. helveticus CNRZ32 produisant les quatre protéases à sa surface ont été sélectionnées. Les activités des systèmes protéolytiques de surface de ces souches ainsi que celles de souches de S. thermophilus ont été testées par hydrolyse des caséines ?s1 et ? dans des conditions in vitro mimant les conditions du fromage, en faisant varier les paramètres de pH et de sel. Par la suite, des mini fromages de type Emmental ont été produits avec les souches les plus protéolytiques.

Nos résultats tendent à montrer que L. helveticus ne présenterait finalement que peu de différences avec les autres bactéries lactiques. En effet, même si certaines souches de L. helveticus peuvent posséder jusqu’à quatre protéases de paroi, seule PrtH3 semble fortement active sur les caséines bovines. In vitro, les souches les plus protéolytiques dégradaient préférentiellement la caséine ? et le taux de dégradation des caséines ?s1 et ? était augmenté à pH 5.2, pH de l'Emmental, comparativement à pH 7.5. Concernant l’effet de la teneur en sel sur l’activité protéolytique des souches de L. helveticus et S. thermophilus in vitro et in situ, les variations observées étaient surtout remarquables pour des concentrations supérieures à celles retrouvées en Emmental (1,5% NaCl m/v). Ainsi, in vitro, une augmentation du taux de sel multiplié par 2 ou 3 semblait diminuer jusqu’à deux fois l’activité protéolytique selon la souche et, en fromage, une augmentation par deux de la teneur en sel conduisait à une baisse de 16% de petits peptides générés.

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