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RP2E INRA Université de Lorraine

Communications

Heterologous Expression of PrtH a Cell Envelope Proteinase of Lactobacillus helveticus in Streptococcus thermophilus LMD-9

8th NIZO dairy conference, 11-13 septembre, Papendal, Pays-Bas

Lecomte, X., Genay, M., Briard-Bion, V., Jardin, J., Lortal, S., Gagnaire, V., Dary, A.

2013

Streptococcus thermophilus et Lactobacillus helveticus sont des bactéries lactiques utilisées comme co-starters dans la fabrication de produits laitiers fermentés. Leur croissance est dépendante d'un apport en acides aminés par le système protéolytique, composé de protéases pariétales (CEP pour Cell Envelope Proteinase) qui hydrolysent les caséines du lait en peptides, de transporteurs de peptides et de peptidases intracellulaires clivant les peptides en acides aminés libres. Alors que la plupart des bactéries lactiques possède une CEP, les souches de L. helveticus peuvent présenter de 1 à 4 gènes de CEP. Par exemple, chez L. helveticus CNRZ32, les quatre protéases PrtH, PrtH2, PrtH3 et PrtH4 sont potentiellement présentes sur la paroi cellulaire et pourraient participer à la génération de peptides techno- et bio-fonctionnels. À ce jour, l'activité et la spécificité de chaque CEP ne sont toujours pas clairement connues même si elles constituent un défi industriel pour la sélection de souches. Les stratégies biochimiques et génétiques se sont révélées inefficaces pour étudier chaque CEP séparément, nous avons donc décidé d'exprimer les CEP à la surface d'une autre bactérie lactique. Notre stratégie a été d'exprimer PrtH sur la paroi cellulaire de S. thermophilus LMD9. Cette souche a été choisie parce qu'elle pousse dans les mêmes conditions de culture que L. helveticus, elle exprime une unique CEP, PrtS, et est naturellement transformable. Trois mutants ont été obtenus par remplacement allélique de PrtS : i) un contrôle négatif PrtS- (gène prtS délété), ii) un mutant PrtH+ exprimant PrtH avec son motif d'ancrage de type S-layer et iii) un mutant PrtH+WANS exprimant PrtH fusionnée au domaine d'ancrage de PrtS. Tous les gènes sont exprimés comme indiqué par RT-qPCR. Cependant, seule la protéase PrtH+WANS a été détectée par shaving des protéines de la paroi cellulaire et identification de ces peptides par HPLC-MS/MS. Ces premiers résultats montrent que S. thermophilus est un bon outil pour sécréter et ancrer des protéines hétérologues. L'étape suivante consiste à exprimer les trois autres protéases de L. helveticus et de déterminer leur activité catalytique sur les protéines du lait.

 

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